近年來，細(xì)胞外囊泡（EV）相關(guān)的研究正加速發(fā)展。2011年每年有約200篇相關(guān)論文發(fā)布，但2016年一年間有1000篇以上的相關(guān)論文發(fā)布，論文內(nèi)容涉及各種生理功能和病理癥狀等方面。EV大致可分為核內(nèi)體來源的外泌體和細(xì)胞質(zhì)膜來源的微囊泡，但即便是用提取純度最高的超速離心法也難以將二者完全分離，所以簡單地將10,000×g離心后上清中的EV稱為小EV（主要是外泌體）^1）。外泌體是由各種細(xì)胞分泌的小型膜囊泡（直徑30~100nm），存在于大多數(shù)體液（如血液、尿液、髓液等）和細(xì)胞培養(yǎng)液中。外泌體是由脂質(zhì)雙層膜包被的膜囊泡，產(chǎn)生于稱為多囊泡體的細(xì)胞外囊泡中，多囊泡體通過與細(xì)胞膜融合將外泌體釋放到細(xì)胞外。外泌體含核內(nèi)體來源的蛋白質(zhì)（如ESCRTs）、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)蛋白（如RabGTPase等）及細(xì)胞膜來源蛋白（如CD63, CD81等）等各種內(nèi)分泌細(xì)胞來源的蛋白和RNA，同時(shí)還含有分泌細(xì)胞膜來源和內(nèi)體膜來源的脂質(zhì)（如膽固醇和鞘磷脂等）^2）。多年來，外泌體被認(rèn)為參與無用的細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)的釋放。但是近年來，外泌體在活體內(nèi)作為運(yùn)載脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA等細(xì)胞間信息傳遞的新型媒介而倍受矚目。隨著其功能在生理及病理功能的闡明，外泌體在臨床應(yīng)用的相關(guān)研究中，特別是診斷治療、生物標(biāo)記的開發(fā)也迅速發(fā)展起來。

　　現(xiàn)在，外泌體研究幾乎涉及所有的研究領(lǐng)域（免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥、內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)等）。例如，免疫細(xì)胞來源的外泌體含有抗原肽/MHC復(fù)合體和可能控制著免疫細(xì)胞間抗原信息的交換、免疫細(xì)胞活化/非活化等各種免疫應(yīng)答機(jī)制的各種抗原^3）。外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)回路的控制相關(guān)^4），同時(shí)各種神經(jīng)退行性疾病的致病蛋白還可以通過外泌體釋放到細(xì)胞外并傳遞到其他細(xì)胞，與病情發(fā)展密切相關(guān)^5）。 癌細(xì)胞釋放的外泌體含有許多與血管新生和免疫逃逸相關(guān)的分子，構(gòu)建適合癌細(xì)胞生長的微環(huán)境，促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展^6）。另外，癌細(xì)胞來源的外泌體上粘著分子的表達(dá)形式?jīng)Q定著癌癥向器官的轉(zhuǎn)移途徑^7）。最近，有報(bào)告指出脂肪細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)肝臟的遺傳基因表達(dá)有控制作用^8）。許多病毒利用外泌體的產(chǎn)生路徑感染細(xì)胞，受病毒感染的細(xì)菌和寄生蟲通過外泌體控制其他受細(xì)胞感染的細(xì)菌、寄生蟲的活動(dòng)^9、10）。

　　上述這些功能幾乎都是通過細(xì)胞分泌到外泌體中的分子引起的。其中已發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)含有分泌細(xì)胞來源mRNA和miRNA，外泌體與細(xì)胞間遺傳基因表達(dá)信息的水平傳播相關(guān)性倍受矚目^11）。這些RNA被外泌體的脂質(zhì)雙層膜所保護(hù)，不會(huì)被核糖核酸酶所分解，可以在血液和體液中穩(wěn)定存在。被靶細(xì)胞吞噬的外泌體通過與內(nèi)體膜融合，將RNA釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。釋放出來的mRNA翻譯為蛋白質(zhì)，但miRNA抑制目的基因的翻譯，因此外泌體在靶細(xì)胞內(nèi)控制基因的表達(dá)。外泌體的蛋白質(zhì)有數(shù)萬種，mRNA、miRNA的種類有數(shù)千種以上，它們的結(jié)構(gòu)除了受細(xì)胞來源不同的影響，還受到細(xì)胞狀態(tài)不同的影響。另外，外泌體中這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與它們在分泌細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)不同，所以可能存在一種外泌體特異蛋白和mRNA/miRNA在外泌體內(nèi)選擇性積累的機(jī)制。這種特異性可將外泌體內(nèi)的RNA作為生物標(biāo)記，更進(jìn)一步作為治療開發(fā)方法的靶點(diǎn)。外泌體中的mRNA一旦被靶細(xì)胞吞噬，能夠引起這個(gè)細(xì)胞內(nèi)的功能性蛋白的表達(dá)，但外泌體中多數(shù)的miRNA是前體而非功能性miRNA，這些miRNA起著何種生理性意義，學(xué)者們正在研究。由于外泌體含有各種蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)，研究人員正將其進(jìn)行細(xì)胞分類，建立數(shù)據(jù)庫（ExoCarta）。此外，在世界各地分別進(jìn)行著運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的大規(guī)模分析工作，而FunRich的EV plugin作為一種通用的分析手段已被公布出來。今后，在推進(jìn)外泌體研究方面，各領(lǐng)域的研究人員信息共享至關(guān)重要。

 ◆運(yùn)用外泌體進(jìn)行治療和診斷的功能開發(fā)

　　隨著外泌體的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，近年來，應(yīng)用這些功能的治療法也在被開發(fā)出來。例如，血液中的成纖維細(xì)胞所釋放的外泌體，可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的移動(dòng)和增殖以及血管新生來促進(jìn)傷口愈合。有報(bào)導(dǎo)指出，外泌體內(nèi)miRNA參與促進(jìn)血管新生、抗炎癥性和促進(jìn)膠原蛋白沉淀等一系列過程^12）。從癌癥患者樹突狀細(xì)胞釋放的外泌體中，含有各種癌癥細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)，可以強(qiáng)化殺傷性T細(xì)胞對(duì)癌癥細(xì)胞的特異性反應(yīng)。利用此功能的抗腫瘤免疫療法，目前正處于初期臨床研究階段^13）。另外，科學(xué)家也嘗試?yán)猛饷隗w的抑制發(fā)病機(jī)制功能。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞所釋放的外泌體，高濃度集聚誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的TNF-α，可使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎惡化^14）。通過上述介紹可以知道癌癥細(xì)胞來源的外泌體含有與癌癥進(jìn)展相關(guān)的分子，神經(jīng)細(xì)胞來源的外泌體含有與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的分子，因此，通過抑制或去除這些外泌體，有希望抑制疾病發(fā)生。隨著今后的研究發(fā)展，外泌體功能逐步清晰，并擴(kuò)大臨床應(yīng)用，有望將外泌體應(yīng)用在各種疾病治療上。甚至可嘗試?yán)猛饷隗w將siRNA和抗癌藥劑等運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞中。各種細(xì)胞粘著分子在外泌體膜表面表達(dá)，由其決定外泌體被運(yùn)輸往哪一種細(xì)胞，期望開發(fā)利用該特征的新型DDS^15）。外泌體在體液中十分穩(wěn)定，同時(shí)外囊泡所含的蛋白質(zhì)和RNA被外泌體的脂質(zhì)雙層膜所包被也不會(huì)分解。另外在從體液中提取外泌體后，體液可長期穩(wěn)定保存，因此外泌體有望成為臨床檢測的新型疾病生物標(biāo)記。外泌體與各種疾病的相關(guān)性被檢測出，特別是血液中釋放的癌細(xì)胞來源的外泌體，其與正常細(xì)胞來源外泌體在結(jié)構(gòu)分子上的差異倍受矚目，并作為癌癥早期診斷技術(shù)，應(yīng)用于與癌癥進(jìn)展相關(guān)的研究^16）。甚至人們期望將尿液中的外泌體作為腎臟、前列腺疾病、膀胱疾病的新型診斷標(biāo)記，髓液中的外泌體作為腦內(nèi)腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的新型標(biāo)記物。

 ◆外泌體研究的課題和展望

　　已經(jīng)有許多關(guān)于外泌體作用的報(bào)導(dǎo)，根據(jù)這些現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)中，從體液和培養(yǎng)上清中高純度提取的高純度外泌體，在活體內(nèi)是否真的能發(fā)生作用尚未能確定。確認(rèn)外泌體生理作用的唯一方法就是明確外泌體的釋放機(jī)制，通過促進(jìn)或抑制釋放機(jī)制，分析會(huì)引起何種生理作用，這是進(jìn)一步研究的發(fā)展方向。甚至活體內(nèi)的外泌體動(dòng)態(tài)（哪個(gè)外泌體遷移至何處）也會(huì)成為今后需要努力研究的重要課題。

　　目前，提取外泌體的方法主要有超速離心法、PEG沉淀法，但這些方法混有非常多的雜質(zhì)，必須慎重分析得到的是否是外泌體。超速離心法存在操作繁雜、回收量不穩(wěn)定，不能用于定量分析、必須使用昂貴的超速離心機(jī)、無法進(jìn)行多樣品分析等問題。因此外泌體研究相對(duì)困難，需要盡快開發(fā)操作簡單、可提取高純度外泌體的技術(shù)。因此，日本和光著眼于巨噬細(xì)胞的外泌體受體Tim4蛋白，制備Tim4細(xì)胞外域與磁珠結(jié)合的“Tim4磁珠”^17）。Tim4通過磷酯酰絲氨酸（PS）法特異性結(jié)合Tim4蛋白和磁珠，再經(jīng)過含有EDTA的洗脫緩沖液進(jìn)行分離，提取高純度的完整外泌體。實(shí)際上，用PS親和法提取的人白血病細(xì)胞釋放的外泌體，其純度與超離心法和PEG沉淀法提取外泌體做比較， PS親和法提取的外泌體，其蛋白特異性檢測可高出10~100倍以上，幾乎沒有混入外泌體以外的蛋白，回收量高，操作重復(fù)性好。結(jié)果表明，PS親和法可以檢測到許多目前為止都無法檢測的外泌體蛋白質(zhì)和RNA。應(yīng)用Tim4的外泌體強(qiáng)結(jié)合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度定性檢測、定量分析外泌體。以前無法用超速離心法提取的微囊泡，也通過運(yùn)用PS親和法實(shí)現(xiàn)高純度提取。本指導(dǎo)書中對(duì)該技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)說明，這項(xiàng)技術(shù)的有用性今后將受到世界各方評(píng)價(jià)，有望在外泌體和微囊泡生理功能的分析研究上起重大貢獻(xiàn)。

　　外泌體的檢測和提取還遇到一個(gè)困難即：對(duì)各種外泌體的分類。研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法提取的細(xì)胞外囊泡可以稱之為外泌體，給實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和重復(fù)性確認(rèn)帶來困難。近年，隨著國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)的成立、世界性研究者研討會(huì)的舉辦，提案MISEV指南作為國際標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)劃或已經(jīng)開始進(jìn)行EV研究的科學(xué)家請務(wù)必閱讀這些方針^{18、19）}。另外，建立記錄各論文實(shí)驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)庫也可作為規(guī)避混亂的方法之一^20）。一方面，隨著EV研究倍受世界矚目，各國啟動(dòng)了大型研究項(xiàng)目。美國啟動(dòng)NIH戰(zhàn)略性大型項(xiàng)目（Extracellular RNA Communication），國際權(quán)威性學(xué)會(huì)——Gordon和Keystone Symposia也從2016開始成立會(huì)議小組。受到歐洲藥物研究開發(fā)公司“創(chuàng)新藥物倡議組織（IMI）”的支持推進(jìn)的CANCER-ID項(xiàng)目，也包含EV研究在內(nèi)。2017年日本選定了EV研究為文部科學(xué)省研究開發(fā)戰(zhàn)略的目標(biāo)之一，期待會(huì)加速今后的研究發(fā)展。無論如何，今后EV研究的根本就是必須有強(qiáng)有力的研究方法和技術(shù)，而PS親和法有望成為其中之一。

◆參考文獻(xiàn)

MagCapture? 外泌體提取試劑盒 PS Ver.2
提高回收率和純化純度的外泌體提取/純化試劑盒

本試劑盒是提取/純化外泌體的試劑盒，比起第一代產(chǎn)品（293-77601 MagCapture? 外泌體提取試劑盒PS），提高了外泌體的回收率和純度，并縮短了實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)間。使用本試劑盒純化的外泌體可以直接用于細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。

◆特點(diǎn)

●　提高了外泌體的回收率和純度

●　縮短親和反應(yīng)的時(shí)間（3 h→1 h）

●　降低純化外泌體的細(xì)胞毒性

◆數(shù)據(jù)

■  比較外泌體的回收率

Western blotting EV標(biāo)記的比較

編輯搜圖

在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的培養(yǎng)上清中，使用第一代產(chǎn)品（圖中簡寫為Ver.1）和本試劑盒（圖中簡寫為Ver.2）提取和純化含外泌體的細(xì)胞外囊泡（圖中簡寫為EV）。然后，對(duì)所得樣品進(jìn)行納米級(jí)粒子數(shù)檢測以及使用PS MagCapture? 外泌體 ELISA Kit（鏈霉親和素HRP）（產(chǎn)品編號(hào)：298-80601）和WB比較EV標(biāo)記物。

Ver.2與Ver.1相比，回收率有所提高。

■　比較純化外泌體的細(xì)胞毒性

編輯搜圖

使用Ver.1和Ver.2提取和純化COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中含外泌體的細(xì)胞外囊泡。然后僅將elution buffer或純化外泌體加入到人正常成纖維細(xì)胞中，觀察經(jīng)過48 h后的細(xì)胞形態(tài)變化。

在Ver.1中，加入外泌體和elution buffer后48 h出現(xiàn)了細(xì)胞死亡，而Ver.2中未觀察到明顯的細(xì)胞毒性。證明Ver.2中elution buffer的細(xì)胞毒性已經(jīng)降低了。

■　比較不同親和反應(yīng)時(shí)間里外泌體純化的回收率

編輯搜圖

在COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中，為Ver.2設(shè)定4個(gè)親和反應(yīng)時(shí)間條件，提取和純化含外泌體的細(xì)胞外囊泡（EV）。然后，獲得的樣品使用PS MagCapture? 外泌體 ELISA 試劑盒（鏈霉親和素HRP）（產(chǎn)品編號(hào)：298-80601）比較EV表面標(biāo)記物。

在Ver.2中，確認(rèn)了1 h的親和反應(yīng)可以充分提取到培養(yǎng)上清中的細(xì)胞外囊泡。

產(chǎn)品列表